ARTIGOS ORIGINAIS
O PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO NA PRESSÃO ANAL ESFINCTERIANA DE RATOS SUBMETIDOS À COLITE EXPERIMENTAL
The Role of Nitric Oxide in Sphincteric Anal Pressure of Rats with Experimental Colitis
Henrique Sarubbi Fillmann1 - TSBCP; NÉlson Kretzmann Filho2; Suzana Llesuy3; LÚcio Sarubbi Fillmann4 - ASBCP; Norma Possa Marroni5
1 Departamento de Fisiologia. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Médico Coloproctologista Hospital São Lucas PUC; 2 Departamento de Fisiologia. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; 3 Departamento de Fisiologia, Universidade Luterana do Brasil e Universidade Federal do Rio Grande do Sul; 4 Departamento de Medicina Interna e Gastroenterologia Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre; 5 Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Santa Maria; Serviço de coloproctologia do Hospital São Lucas da PUC. Faculdade de Medicina da PUC-RS - Brasil.
RESUMO: O óxido nítrico (NO) é um radical livre sintetizado endogenamente por várias células do nosso organismo. Apresenta um amplo espectro de ações fisiológicas, sendo as mais importantes o seu mecanismo de ação parácrino no relaxamento da musculatura lisa, sua atividade neurotransmissora em vários sistemas e seu envolvimento no processo inflamatório. O NO é sintetizado em diferentes tecidos através da conversão da L-arginina em L-citrulina pela ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS) . Objetivos: Este estudo tem por objetivo demonstrar o envolvimento do óxido nítrico no processo intestinal inflamatório de ratos Wistar submetidos à colite experimental com ácido acético. Material e métodos: Foram utilizados 20 ratos machos Wistar, com peso entre 250 e 350 gramas divididos em dois grupos de 10 animais. Os animais do grupo em estudo foram submetidos à administração intracolônica, por enema, de uma solução de ácido acético diluído a 7% e com volume de 3 ml. O grupo controle recebeu apenas enema de solução salina. Foram avaliados os índices histológicos, a expressão da enzima óxido nítrico sintase (iNOS) e a pressão anal esfincteriana. Resultados: Os índices histológicos apresentaram uma significativa elevação no grupo colite quando comparados ao grupo controle, tanto na avaliação macroscópica quanto na microscópica. A expressão da enzima iNOS também foi significativamente maior no grupo colite quando comparada ao grupo controle. A pressão anal esfincteriana foi significativamente mais baixa no grupo colite na comparação ao grupo controle. Conclusão: Os animais submetidos à colite experimental apresentam um aumento da expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (i-NOS). Este aumento, associado ao conseqüente aumento do nível de óxido nítrico, ocasiona uma diminuição dos níveis de pressão anal esfincteriana.
Descritores: Óxido nítrico; colite; pressão anal esfincteriana.
INTRODUÇÃO
O óxido nítrico (NO) é um radical livre
sintetizado endogenamente por várias células do nosso
organismo e inicialmente conhecido como fator relaxante
do endotélio (EDRF). Apresenta um amplo espectro
de ações fisiológicas sendo as mais importantes o seu
mecanismo de ação parácrino no relaxamento da
musculatura lisa, sua atividade neurotransmissora em vários
sistemas e seu envolvimento no processo inflamatório
1,2.
O NO é sintetizado em diferentes tecidos
através da conversão da L-arginina em L-citrulina
pela ação da enzima óxido nítrico sintase
(NOS)3. Formas constitutivas (cNOS) assim como induzidas
(iNOS) foram descritas. As formas constitutivas da
enzima responsável pela produção de óxido nítrico são a
nNOS (neuronal) e a eNOS (endotelial). A produção de
óxido nítrico através das isoformas constitutivas de NOS
são essenciais para a manutenção de tecidos,
integridade vascular, neurotransmissão, motilidade intestinal e
relaxamento da musculatura anal
esfincteriana4. No entanto, é a forma induzível (iNOS) que apresenta
expressão aumentada em manifestações da doença
intestinal inflamatória e especialmente no foco da
inflamação associada com ulceração e depleção de
células caliciformes5 . Estudos demonstram que um
aumento do NO está relacionado com um aumento na
expressão da iNOS6 e isto contribui significativamente
na imunopatia gastrintestinal durante eventos crônicos
de inflamação7. O papel exato do aumento da
concentração de óxido nítrico na fisiopatologia da doença
intestinal inflamatória ainda é motivo de muita
discussão; entretanto, inúmeros estudos demonstraram um
papel benéfico desta molécula nesta situação. É bem
conhecida a ação do óxido nítrico diminuindo o
recrutamento leucocitário no endotélio através da sua atividade
inibitória sobre as moléculas de adesão. A diminuição da
produção de IL-12 por macrófagos também foi
demonstrada em animais submetidos à colite experimental.
Em ambos os casos há uma ação direta do óxido nítrico
inibindo o processo inflamatório. Já foi demonstrado
que ratos modificados geneticamente para não
produzirem iNOS desenvolviam uma colite muito mais severa
em resposta ao ácido acético do que os animais
controles8,9.
Este estudo tem por objetivo demonstrar o envolvimento do óxido nítrico no processo intestinal
inflamatório de ratos Wistar submetidos à colite
experimental com ácido acético. As medidas de
expressão da iNOS e da manometria ano-retal serão
os parâmetros utilizados para avaliar a presença do
óxido nítrico neste modelo experimental. A histologia
será utilizada para demonstrar a presença de colite.
MATERIAL E MÉTODOS
A realização dos procedimentos com os
animais deste trabalho é de acordo com aqueles
preconizados pela Comissão de Pesquisa e Ética em Saúde
do Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação do Hospital
de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) pela
resolução normativa 04/97 10.
1-Animais
Foram utilizados 20 ratos machos Wistar divididos em dois grupos: colite (CL) e controle (CO),
com peso entre 250 e 350 gramas, provenientes do
Centro de Reprodução e Experimentação de Animais de
Laboratório (CREAL) do Instituto de Ciências
Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande
do Sul (UFRGS). Os animais foram mantidos no
Centro de Experimentação Animal do HCPA durante o
experimento, em ciclo de 12 horas claro/escuro e
temperatura entre 20 e 25ºC. A água e a ração foram
administradas ad libitum. A técnica escolhida para a
indução da colite foi uma adaptação daquelas descritas
por Yamada et al. (1992) e Tannahill et al. (1995). Os
animais foram submetidos à administração
intracolônica, por enema, de uma solução de ácido acético diluído
a 7% e com volume de 3 ml. Para a administração
do enema foi utilizado um cateter plástico de 0,8mm
de diâmetro com três orifícios distais para melhor
dispersão da substância. O cateter foi introduzido a
aproximadamente 8 cm da margem anal, sendo retirado
gradualmente com a instilação do ácido acético. A
morte dos animais foi realizada após as medidas de
pressão, com anestesia do animal mediante a administração
de uma mistura de Cloridrato de Xilazina 2% 50mg/Kg
e Cloridrato de Cetamina 100mg/Kg de peso corporal intraperitonialmente para retirada do intestino
grosso distal (2,5 cm). Após foi realizado o pneumotórax
para a morte do animal.
2 - Exame Anátomopatológico e Histopatológico
Após o sacrifício, foi promovida a retirada
completa do intestino grosso. Este foi aberto, limpo e
encaminhado para a análise histológica que se realizou
em duas etapas:
MACROSCÓPICA - Foi realizada análise macroscópica do intestino grosso logo após o sacrifício e abertura do mesmo. Os danos à mucosa foram avaliados através de um escore que varia de 0 a 5, adaptado de Morris et al11.
MICROSCÓPICA - Uma vez fixado em formol a 10%, o material foi enviado ao patologista para análise microscópica em hematoxilina e eosina. O protocolo para avaliação histológica da mucosa baseia-se no Índice Histológico de Atividade Inflamatória descrito por Sandborn12. Todas as lâminas foram lidas por patologistas experientes, sem conhecimento prévio das características de cada animal e com acesso somente aos seus próprios resultados.
3 - Medidas de Pressão Anal Esfincteriana
Antes da morte, os animais foram levemente anestesiados com Isoflurano® para a realização
das medidas de pressão anal esfincteriana. Utilizamos
um aparelho de manometria anorretal (Proctossystem-Viotti _ SP) com cateter de balão e medida em cm
de H2O. Foram realizadas três medidas
subseqüentes, sendo realizada a média entre os três valores. (Read
et al, 1992) 13.
4 - Preparação dos Extratos Citoplasmáticos
Os extratos citoplasmáticos utilizados para
a expressão da iNOS foram preparados por um homogeneizado do intestino em um tampão de
lise (NaCl 140 mM, EDTA 15 mM, glicerol 10%, Tris
20 mM; pH 8,0), ao qual se adicionaram inibidores
de proteases. O homogeneizado foi incubado durante
30 minutos a 4 ºC, sendo centrifugado durante 30
minutos a 13.000 xg a 4 ºC, o sobrenadante retirado em
alíquotas e armazenado a -80°C.
5 - Expressão Protéica
A técnica utilizada para detecção da
expressão iNOS foi a de Western blot, sendo utilizado o
sistema descrito por Laemmli (1970) para a
eletroforese e para o blotting a técnica descrita por Towbin e
colaboradores (Towbin et al, 1979). Foi selecionada
uma quantidade de amostra equivalente a 75 µg de
proteína; adicionou-se a solução (H2O, tris/HCl 0,5 M,
DTT 1% e azul de bromofenol), incubando durante 5
minutos a 100 ºC. Após realizou-se a eletroforese em
gel de poliacrilamida a 10% em tampão de
eletroforese (Tris 25 mM, glicina 0,2 M, SDS 3,5 mM; pH
8,8). Depois de separadas, as proteínas foram
transferidas para uma membrana de nitrocelulose, a fim de
permitir a sua exposição aos anticorpos. Para realizar
a transferência, uma vez extraído o gel, este foi
equilibrado num tampão de transferência (Tris 25
mM, glicina 0,2 M e metanol 20%). A transferência se
realizou a 13 volts durante 25 minutos. Para
comprovar que a transferência estava correta, introduziu-se
a membrana de nitrocelulose numa solução de
vermelho Ponceau para visualizar as proteínas totais.
A membrana foi lavada em agitação durante 5
minutos com PBS (0,14 M NaCl, 1,4 mM
KH2PO4, 8 mM
Na2HPO4, 2,7 mM KCl). Depois foi colocada
durante 30 minutos em solução de bloqueio (5% de leite
em pó desnatado em PBS-Tween 20 frio) a 37ºC.
A membrana de nitrocelulose foi então
incubada overnight a 4º C com o anticorpo primário
policlonal específico para iNOS (130 kDa, BioMol®). Após
este período, a mesma foi lavada 5 vezes com
PBS-Tween 20. Posteriormente foi incubada durante uma hora
e meia com um anticorpo anti-imunoglobulina de coelho unido a HRP (DAKO A/S, Glostrup,
Dinamarca). Transcorrido este tempo novamente foi lavada 5
vezes em PBS-Tween 20. A detecção das proteínas
foi realizada por quimiluminescência utilizando um
kit comercial ECL (Amersham Pharmacia Biotech,
Little Chalfont, Grã-Bretanha), expondo a membrana
durante 2 minutos a esta mistura comercial.
Posteriormente se introduziu a membrana em um cassete
junto com o filme de revelação (Amersham Hyperfilm
ECL, UK) durante aproximadamente 2 minutos. Depois
de revelado, o filme foi secado e quantificadas as
bandas por densitometria, utilizando o programa
Scion Image 4.02 para Windows (Scion Corporation, Frederick, USA). Os resultados foram expressos
em unidades arbitrárias. A diluição utilizada para
o anticorpo da iNOS foi 1/1000 em leite a 1%.
6 - Estudo Estatístico
O teste utilizado para análise de variância
dos resultados foi de ANOVA para medidas repetidas
dos animais de um mesmo grupo e entre grupos
diferentes, a fim de podermos comparar as diferenças
observadas em cada parâmetro estudado seguido do
teste Student-Newman-Keuls. Os resultados foram
expressos como média e desvio padrão para cada um
dos grupos do experimento.
RESULTADOS
A avaliação histológica demonstra nas
figuras 1 e 2 a preservação da estrutura de todas as
camadas da parede do intestino grosso no grupo controle.
Nas figuras 3 e 4, observa-se importante destruição
da mucosa com edema de submucosa, infiltrado
inflamatório e destruição de vasos do grupo submetido à
colite experimental. A tabela 1 descreve os índices de
avaliação histológica macroscópica e microscópica
em ambos os grupos.
A pressão anal esfincteriana está
significativamente diminuída no grupo colite quando
comparado ao grupo controle. Na tabela 1 observa-se a
variação de pressão anal esfincteriana entre os dois grupos,
comparando-os aos índices histológicos.
Os valores da expressão da enzima iNOS
está significativamente aumentado no grupo colite
quando comparado ao grupo controle (Figura 5). A
importante relação entre o aumento da expressão desta enzima
e a diminuição da pressão anal esfincteriana está
demonstrada na tabela 2.
Figura 1 - Fotomicrografia do intestino grosso de animais do grupo controle. Epitélio glandular (EG), submucosa (SM) com vasos e as camadas musculares circulares e longitudinais (M), luz intestinal (L) 40X. |
Figura 2 - Fotomicrografia do intestino grosso de animais do grupo controle. Epitélio simples glandular (EG), a lâmina própria (LP), a muscular da mucosa (MM), submucosa (SM) com vasos e as camadas musculares circulares (MC) e longitudinais (ML), 200X. |
Figura 3 - Fotomicrografia do intestino grosso de animais do grupo colite. Destruição das criptas (CP) com extenso edema de submucosa (E) 100X. |
Figura 4 - Fotomicrografia do intestino grosso de animais do grupo colite. Destruição das criptas (CP) com extenso edema de submucosa (E) e infiltrado inflamatório (IF), 100X. |
DISCUSSÃO
As limitações no conhecimento da etiologia
da doença intestinal inflamatória, bem como a
inexistência de marcadores específicos da atividade da doença
dificulta as intervenções terapêuticas que, desta
maneira, concentram-se principalmente no combate às
conseqüências da amplificação das cascatas
inflamatórias e às repercussões sistêmicas
destas14.
A utilização de modelos experimentais é
amplamente aceita, pois a maioria das inflamações
intestinais apresenta as mesmas características clínicas,
independentemente do seu agente etiológico. Os
mecanismos desencadeantes e reguladores do processo
inflamatório na colite experimental não parecem
diferir daqueles encontrados em humanos. Uma vez que
nem sempre tem-se o número de pacientes necessários
para um estudo ou os riscos oriundos da pesquisa são
muito grandes, vários modelos experimentais de colite
têm sido desenvolvidos. Warren e
Watkins15 descreveram vários modelos animais de doença intestinal
inflamatória, podendo ser classificados de acordo com as
suas características de apresentação (aguda ou crônica
), pela maneira de desenvolvimento (induzido ou
espontâneo) ou ainda pela forma de indução (tóxica,
infecciosa, imunomediada). Os dois modelos mais freqüentemente utilizados são a indução sob a
forma de enema com ácido acético e com ácido trinitri
benzeno sulfúrico (TNBS)16,17.
A avaliação histológica do cólon dos
animais em estudo é um método altamente fidedigno e
utilizado para identificação e quantificação da colite
5,18,19,20,21. Infiltrado celular inflamatório, destruição da
arquitetura das criptas, depleção de células caliciformes,
hemorragia na submucosa, edema de parede e ulcerações são alguns dos parâmetros utilizados para o
diagnóstico e quantificação da colite. Morris e
Sandborn11,12 desenvolveram um método que permite quantificar
e classificar o grau de inflamação no cólon micro
e macroscopicamente, respectivamente. Este
método vem sendo usado para facilitar a comparação
entre diferentes grupos de estudo. Em nosso estudo
observou-se um nítido aumento dos escores inflamatórios
no grupo colite, quando comparados com o grupo
controle tanto nos índices macroscópicos (CL 3,75 X CO
zero) quanto nos microscópicos (CL 4 X CO zero),
demonstrando, portanto, a evidência histológica de colite.
Figura 5 - Expressão da NO sintase induzível (iNOS). A) Representação da análise por Western blot. B) Valores foram expressos pela média + desvio padrão da média (DP) de três diferentes observações.
|
O óxido nítrico exerce várias importantes
funções antinflamatórias, tais como a regulação da
expressão de moléculas de adesão, prevenção da
agregação plaquetária, estímulo à síntese de GMPc e
inibição da lipoperoxidação. O seu potencial efeito na
doença intestinal inflamatória, entretanto, ainda
suscita discussão. Baseados na literatura atual, é difícil
concluir se o óxido nítrico participa na progressão do
processo inflamatório na colite ou se apresenta um
efeito benéfico, preservando a mucosa e prevenindo o
recrutamento de leucócitos para o tecido colônico 22,23,24.
O presente trabalho confirma os achados de trabalhos anteriores que demonstraram um
aumento da produção de óxido nítrico na colite, quando
comparado ao grupo controle. (CL 0,49U X CO 0,22U).
O método que utilizamos neste estudo foi a dosagem
da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) pela
técnica de Western Blot. Como já foi citado
anteriormente, em situações de atividade inflamatória o óxido
nítrico é sintetizado através da ação da iNOS convertendo
a L-arginina em L-citrulina e óxido nítrico. O
principal sitio de formação e liberação da isoforma induzível é
o macrófago onde a produção é estimulada em
resposta a infecção, endotoxina bacteriana e citoquinas como
a IL2 e a TNF.
As medidas de pressão esfincteriana
através de manometria ano-retal variaram
significativamente entre os dois grupos. O grupo de animais com
colite apresentou níveis de pressão esfincteriana
significativamente inferiores ao grupo controle (CO 68cm
H2O X CL 30cm H2O).
Estudos recentes da musculatura lisa dos esfíncteres do trato gastrintestinal de ratos sugerem
que o óxido nítrico é um dos mediadores
ou neurotransmissores
inibitórios25,26. Esta sugestão
baseia-se principalmente na ação direta inibitória do óxido
nítrico sobre a musculatura lisa. O esfíncter anal interno é
um músculo liso que reconhecidamente apresenta-se sob
o controle inibitório do óxido nítrico. Estudos
demonstram a liberação de óxido nítrico em resposta à
estimulação de neurônios não-adrenérgicos e
não-colinérgicos (NANC) do esfíncter anal interno. Experimentos
realizados em ratos com estimulação dos neurônios
NANC e bloqueio adrenérgico e colinérgico demonstraram
um relaxamento da musculatura esfincteriana, associado
a uma maior liberação de óxido
nítrico27.
Atualmente é bem aceito o conceito de que
o óxido nítrico é formado e liberado por células
endoteliais e que possui um importante efeito relaxante sobre
a musculatura lisa dos vasos. Recentemente; porém,
um espectro mais amplo de ação do óxido nítrico vem
sendo evidenciado no que se refere à musculatura
lisa. Observa-se um efeito de segundo mensageiro,
mediador e também de neurotransmissor inibitório
responsável pelo relaxamento da musculatura lisa intestinal.
Estas evidências são suportadas pelo efeito relaxante
obtido com a L-arginina, bloqueio do relaxamento pelo uso
de inibidores da L-arginina (L-NNA) e pelo efeito
direto do óxido nítrico sobre a musculatura lisa vascular
e intestinal 28,29.
A origem do óxido nítrico que atua sobre
a musculatura anal esfincteriana ainda não é bem
clara. Entretanto, parecem existir algumas evidências de
que as células musculares lisas do intestino possam ser
as responsáveis pela síntese e liberação de óxido
nítrico em resposta à neurotransmissão inibitória. De
acordo com o que foi investigado, parte do processo de
relaxamento da musculatura lisa intestinal em resposta
ao neurotransmissor VIP é mediada pela liberação de
óxido nítrico pelas próprias células da musculatura lisa.
Esta sugestão é fortalecida pelo fato do VIP ocasionar
relaxamento do músculo esfíncter anal interno, ao
mesmo tempo em que ocorre um aumento de liberação de
óxido nítrico. Além disso, este relaxamento do
músculo esfíncter anal interno induzido pelo VIP é
bloqueado pela presença de inibidores da
NOS30,31.
Assim sendo, podemos concluir que, baseados nos resultados deste trabalho, os animais submetidos
à colite experimental apresentam um aumento da
expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível
(i-NOS). Este aumento, associado ao conseqüente aumento
do nível de óxido nítrico, ocasiona uma diminuição dos
níveis de pressão anal esfincteriana.
ABSTRACT: The nitric oxide (NO) is a free radical synthesized from some cells of our organism. It presents with an
ample specter of physiological actions being the most important its mechanism of action in the relaxation of the smooth
musculature, its neurotransmissor activity in some systems and its involvement in the inflammatory process. The NO is synthesized
in different tissues by the conversion of the L-arginine in L-citruline with the action of the enzyme nitric oxide
sintase(NOS). Objectives: the aim of this study is to demonstrate the involvement of nitric oxide in the inflammatory intestinal process
of Wistar rats submitted to experimental colitis with ascetic acid. Material and methods: 20 male Wistar rats had been used
with weight between 250 and 350 g divided in two groups of 10 animals. The animals of the group in study had been submitted
to intracolonic administration, by enema, of a solution with acid ascetic diluted to 7% - 3 ml. The control group received only
enema with saline solution. The histological scores, the expression of the enzyme nitric oxide sintase (iNOS) and the sphincteric
anal pressure had been evaluated. Results: The histological scores had presented a significant rise in the group colitis when
compared with the control group in the macroscopic as well as in the microscopical evaluation. The expression of the enzyme iNOS was
also significantly higher in the colitis group when compared to the control group. The sphincteric anal pressure was
significantly lower in the group colitis when compared to control group. Conclusion: The animals submitted to the experimental
colitis presented an increase of the iNOS expression. This increase, associated with the consequent increase in nitric oxide
level, causes a reduction of the sphincteric anal pressure levels.
Key words: Nitric oxide; colitis; anal sphincter pressure.
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Endereço para
correspondência: CP
Henrique Sarubbi Fillmann
Avenida Ipiranga, 6690 _ conj. 307
90.610-000 - Porto Alegre (RS)
Fone: (51) 3336-5254
E-mail: hfillmann@terra.com.br
Recebido em 11/10/2006
Aceito para publicação em 27/10/2006
Trabalho realizado Hospital de Clínicas de Porto Alegre _ HCPA / Universidade Federal do Rio Grande do Sul _ UFRGS, Laboratório
de Hepatologia Experimental - Fisiologia, Porto Alegre, RS, Brasil. Universidade Luterana do Brasil, ULBRA, Curso de Fisioterapia, Laboratório
de Estresse Oxidativo, Canoas, RS.