SEÇÃO GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

Apesar da grande evolução ocorrida no conhecimento da biologia molecular do câncer colorretal ao longo dos últimos anos, permanecem dúvidas a respeito de seu potencial valor clínico. A detecção de um número cada vez maior de marcadores moleculares com valor prognóstico tem gerado uma percepção de que apenas a possibilidade de uma futura análise global do perfil genômico de cada tumor individual pode vir a representar uma esperança para a exata definição do comportamento biológico tumoral.
    Entretanto, estudos paralelos têm revelado a existência de um subgrupo de tumores malignos do colon e reto os quais apresentam características peculiares e semelhantes entre si quanto à forma de apresentação, comportamento biológico e prognóstico. São estes os tumores cuja fisiopatologia está aparentemente relacionada à existência de êrros de replicação ou simplesmente tumores RER (+).
    O diagnóstico destes tumores é feito através de um exame de crescente importância denominado como pesquisa de instabilidade de microssatélites (IMS). Para a compreensão deste exame assim como de seu significado, torna-se necessário o conhecimento de alguns conceitos os quais buscaremos rever na presente seção.

1. O que são microssatélites ?
Como sabemos, o DNA humano é formado por uma molécula que poderia atingir a extensão de um a dois metros de extensão se fosse hipotéticamente desenrolada. Esta molécula em dupla fita é composta por uma seqüência de cerca de três bilhões de pares de nucleotídeos, ou seja, adenina (A), timina (T), citosina (C) ou guanina (G). Sabemos que cerca de 60 a 75% destes nucleotídeos são compostos por seqüências únicas, ou seja, segmentos cuja organização de nucleotídeos ocorre apenas uma vez em todo o genoma. Dentre estas seqüências únicas estão os genes, que são seqüências contendo o código para a síntese de proteínas, os quais representam cerca de 5 a 10% de todo o genoma.
    Os 25 a 40% restantes da molécula de DNA são formados pelas seqüências repetitivas de DNA, as quais podem ser observadas diversas vezes em todo o genoma. Estas seqüências de nucleotídeos podem ser subdivididas em repetições dispersas e repetições tandem (ou satélites), sendo este nome devido ao aparecimento à espectrometria ótica de uma banda "anexa" (ou "satélite") junto à banda principal.As repetições tandem do DNA podem ser classificadas de acordo com a extensão da seqüência repetitiva em satélites, minissatélites e microssatélites.Enquanto as seqüências satélites são mais extensas, os chamados minissatélites são compostos por repetições de 9 a 80 pares de bases nucleotídicas (pb) e os microssatélites consistem de pequenas repetições incluindo apenas um a seis nucleotídeos.Assim sendo, podem ser estes microssatélites compostos por um mononucleotídeo(Ex:AAAAAAAAAAAAA), dinucleotídeo (Ex:CACACACACACACA), trinucleotídeo (Ex: CAGCAGCAGCAGCAG), etc. O número de repetições de minissatélites e microssatélites pode variar entre os indivíduos, motivo pelo qual são consideradas como as impressões digitais do DNA de cada um e são utilizadas em exames para verificação de paternidade.

2. O que é instabilidade de microssatélites ?
É a observação de que o DNA extraído de células de determinados tumores apresentam alterações no número de unidades repetidas em um ou mais microssatélites quando comparados aos mesmos microssatélites existentes em amostras de DNA de um tecido normal do mesmo individuo, como aquele obtido nas células sanguíneas, por exemplo. Dito de outra forma, as células tumorais apresentam "impressões digitais" defeituosas em seu DNA quando comparadas aos outros tecidos do organismo.

3. Qual o significado da instabilidade de microssatélites (IMS) ?
O DNA é uma molécula instável e sofre freqüentes alterações através de perdas de segmentos, mutações ocorridas durante o processo de divisão celular, etc. Para corrigir tais alterações dispomos de algumas proteínas com função de realizar os reparos necessários para manter a integridade do DNA. Estas proteínas são produzidas a partir de alguns genes conhecidos como genes de reparo (mismatch repair genes _ MMR) e sua função é exercida de forma contínua, preservando os tecidos celulares.
    A observação de um grande número de alterações nas seqüências de microssatélites em um determinado tecido tumoral demonstra a ausência de uma função normal de reparo de DNA. Representa, conseqüentemente, uma evidência indireta de que existe uma deficiência na ação das proteínas de reparo causada pela presença de mutações.
    A este tipo de defeito genético denominamos erros de replicação (replication errors _ RER +).

4. Como é diagnosticada a presença de instabilidade de microssatélites (IMS) ?
Este diagnóstico é realizado através da comparação entre as características dos microssatélites do tecido tumoral e de um tecido normal do indivíduo em questão, como sangue, por exemplo. Após a coleta dos tecidos, é feita a extração do DNA de ambos e a amplificação deste através de um procedimento denominado reação em cadeia da polimerase (PCR).Em seguida, a extensão de um ou mais microssatélites é comparada entre os dois tecidos através de técnicas de biologia molecular utilizando eletroforese. A fim de otimizar os resultados e reduzir falsos negativos, um painel organizado pelo Instituto Nacional de Câncer dos Estados Unidos sugere que sejam pesquisados sempre cinco microssatélites como marcadores. Entretanto, devido à complexidade do exame alguns autores acreditam que a pesquisa de um único microssatélite, denominado como BAT26, pode ser suficiente para evidenciar a existência de IMS devido à sua elevada incidência de mutações nestes casos, facilitando a palicação clínica deste teste em maior escala.

5. Como são apresentados os resultados da pesquisa de IMS ?
O resultado destes exames podem ser apresentados simplesmente como positivos ou negativos pela simples demonstração ou não de uma banda extra na eletroforese. Entretanto, exames mais sofisticados pesquisando um maior número de microssatélites podem oferecer um maior detalhamento de acordo com freqüência de alterações entre os microssatélites estudados. Desta forma, os tumores colorretais poderão ser classificados entre aqueles com elevada freqüência de instabilidade (MSI-H), baixa freqüência de instabilidade (MSI-L) ou sem instabilidade (microssatélite estável ou MSS).

6. A pesquisa de instabilidade de microssatélites é a única forma de avaliar a existência de erros de replicação no DNA tumoral ?
Não. Como dissemos acima, a observação de alterações nos microssatélites é uma forma indireta de avaliarmos uma possível existência de defeitos na ação das proteínas de reparo. Assim sendo, uma forma alternativa de identificar tumores cuja origem esteja relacionada a erros de replicação é a avaliação das próprias proteínas de reparo. Embora tenham sido identificadas até hoje seis proteínas de reparo, cerca de 90% das mutações são encontradas em apenas duas destas, denominadas como hMLH1 e a hMSH2. O estudo destas proteínas através de técnicas de imunohistoquímica ou de seus genes através de sequenciamento direto tem sido relatado como opções confiáveis para a detecção de tumores com erros de replicação.

7. O câncer colorretal associado à IMS apresenta características especiais ?
Sim, e este é um aspecto muito importante. Existem evidências bem estabelecidas de que tumores colorretais malignos com erros de replicação (ou IMS +) apresentam características que os destacam em diversos aspectos, quanto ao local de incidência, idade, aspectos histológicos e prognóstico, conforme descrito abaixo:
* Predomínio em localização proximal no colon;
* Maior incidência em idades mais precoces (abaixo de 40 a 50 anos);
* Maior incidência de tumores múltiplos;
* Maior incidência de tumores mucinosos;
* Pior diferenciação tumoral;
* Melhor sobrevida em relação ao câncer colorretal estável para microssatélites;

8. Quais as evidências atuais em relação ao melhor prognóstico do câncer colorretal com erros de replicação (IMS +) ?
Existem diversos estudos comparando a sobrevida entre pacientes portadores de câncer colorretal com ou sem erros de replicação. Conforme demonstrado na Tabela-1 abaixo, a maior parte destes demonstra uma significativa vantagem no prognóstico em tumores com instabilidade de microssatélites.

Tabela 1 - Análise da sobrevida em portadores de câncer colorretal com ou sem instabilidade de microssatélites

9. Qual a relação entre IMS e o câncer hereditário ?
A perda de função de algumas proteínas de reparo é considerada como a base fisiopatológica biomolecular da síndrome hereditária conhecida como câncer colorretal hereditário não-polipóide (HNPCC). Conseqüentemente, a presença de instabilidade de microssatélite deve ser esperada na quase totalidade destes casos, cujos tumores apresentam as características descritas acima.

10. Pode ocorrer IMS em tumores colorretais esporádicos (não hereditários) ?
Sim. Conforme vemos na Tabela-2, os estudos envolvendo tumores esporádicos em geral referem que cerca de 10-15% destes apresentam instabilidade de microssatélites, confirmando a existência de erros de replicação do DNA. Entretanto, os estudos realizados apenas nos tumores incidentes em pacientes mais jovens ou localizados em segmentos proximais do colon demonstram um índice de positividade bastante maior de instabilidade de microssatélites. Por outro lado, em um estudo restrito a tumores de reto a incidência de erros de replicação reduziu-se a apenas 2% dos casos, confirmando a relação entre a instabilidade de microssatélites e tumores situados em colon direito ou transverso.
    É importante notar que o câncer colorretal associado a erros de replicação irá apresentar o mesmo tipo de localização e comportamento biológico independentemente de sua natureza esporádica ou hereditária (HNPCC).

Tabela 2 - Incidência de positividade para instabilidade de microssatélites em séries de câncer colorretal esporádico (apenas MSI-H considerados)

11. Quando deve ser indicada a pesquisa de IMS ?
O custo e complexidade da pesquisa de instabilidade de microssatélites e a relativamente baixa incidência de alterações são fatores que contribuem para que este exame não seja indicado como procedimento de rotina em todos os casos de câncer colorretal. Entretanto, está indicada sua realização em um grupo de pacientes portadores de câncer colorretal que preencha algumas das características compatíveis com tumores com erros de replicação.
    Para padronizar as indicações de pesquisa de IMS foram elaborados os chamados Critérios de Bethesda, a saber:
* Individuos com tumores em famílias que preencham os critérios de Amsterdam para câncer colorretal familiar não-polipóide (HNPCC). (Tabela 3)
* Indivíduos com dois tumores relacionados à HNPCC, incluindo câncer colorretal sincrônico, metacrônico ou tumores associados extracolônicos.
* Indivíduos com câncer colorretal e um parente em primeiro grau com história de adenoma ou câncer colorretal ou tumor extra-colônico associado à HNPCC. Um dos tumores malignos deve ter sido diagnosticado antes dos 45 anos e o adenoma antes de 40 anos.
* Indivíduos com câncer colorretal ou endometrial diagnosticado antes dos 45 anos.
* Indivíduos com câncer colorretal proximal pouco diferenciado diagnosticado antes dos 45 anos.
* Indivíduos com câncer colorretal com células em anel de sinete diagnosticado antes dos 45 anos.
* Indivíduos com adenomas diagnosticados abaixo dos 40 anos.

Tabela 3 - Critérios de Amsterdam para o diagnóstico de câncer colorretal hereditário não-polipóide (HNPCC)

12. Qual a conduta a ser seguida nos casos de câncer colorretal associado à IMS ?
A detecção de instabilidade de microssatélites em um paciente com suspeita clínica de pertencer a uma família de HNPCC pode ser de grande importância devido à possibilidade de oferecer a possibilidade de cuidados adequados de rastreamento e diagnóstico precoce em outros membros da mesma família em risco. Além disto, poderá orientar quanto à oportunidade de realizar-se nestas famílias testes de sequenciamento de genes de reparo para a identificação das mutações presentes.
    Considerando-se a necessidade de identificar cada vez mais o comportamento biológico individual dos tumores, o diagnóstico de erros de replicação no câncer colorretal esporádico torna-se um avanço bastante importante devido ao seu prognóstico diferenciado e à possibilidade de oferecer um tratamento mais específico e adequado a cada paciente.

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